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谈多目标同步优化黄马缓释喷雾膜剂的基质处方
学习啦在线学习网 黄马酊是重庆市中医研究院经典医院制剂，由酒黄连和制马钱子两味药材组成，具有疏通经络、活血止痛、解毒消肿、消淤散结的功效，临床上主要外用于血管栓塞性脉管炎( 即中医脱疽) 、疮痈、丹毒、褥疮等皮肤痒痛证的治疗。酊剂具有制备简单、释药迅速等优点，但有流动性大，含醇量高，对溃疡面具强烈刺激性，以及较短时间内需重复用药等缺点而影响其临床使用。本研究采用喷雾膜剂技术对黄马酊进行剂型改革。喷雾膜剂兼顾喷雾剂和膜剂的双重优点，既可呈雾状喷出，同时快速成膜，可有效保护溃疡面，减小刺激性并缓慢长效释放药物，携带方便，从而提高临床疗效及患者用药的顺应性。本研究采用正交设计，以PVA17-88、乙醇和甘油用量为考察因素，以制剂的成膜性能、士的宁及盐酸小檗碱在8 h 内的累积释放率为综合评价指标，优选出膜剂的最佳基质配方，并对其体外释放及经皮渗透等作用进行考察。
1 仪器与材料
1. 1 仪器
安捷伦1260 高效液相色谱仪; DAD 紫外检测器; AB204-E 型分析天平( 瑞士梅特勒-托利公司) ; RYJ-6A 型药物透皮扩散试验仪( 上海黄海药检仪器厂) ; A01-10mL 喷雾瓶( 陕西博迪塑胶有限责任公司) 。
1. 2 试药
实验用酒黄连( 批号: 913-8902) 、制马钱子( 批号: 121201) 药材购自四川欣康中药饮片有限公司，由笔者刘新教授鉴定均为正品。士的宁( 批号: 110705-200306) 、盐酸小檗碱( 批号: 110713-200609) 对照品均购自中国食品药品检定研究院;聚乙烯醇( PVA17-88，分析纯，批号: 2013101701，成都市科龙化工试剂厂) ; 水为超纯水; 甲醇、乙腈为色谱纯; 其余试剂均为分析纯。
1. 3 实验
学习啦在线学习网 动物清洁级健康SD 大鼠，雄性，体质量( 250 20) g，由重庆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号: SCXK-( 渝) 2014-0001。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱: ODS-3 C18柱( 250 mm 4. 6 mm，5 流动相: 甲醇-乙腈-( 0. 1 mol /L磷酸二氢钠-0. 025 mol /L 十二烷基硫酸钠溶液) =50∶ 25∶ 25; 检测波长: 254 nm; 柱温: 30 ℃; 流速: 1. 0mL /min; 理论板数以士的宁峰计应不低于5 000。
2. 2 黄马缓释喷雾膜剂的制备
取处方量PVA17-88 加适量水溶胀，溶解，加入处方量甘油、酒黄连与制马钱子的70% 乙醇渗漉提取液、乙醇适量，搅拌均匀，最后以水补足量，即得。另同法制备不含药液的空白膜溶液作为对照。
学习啦在线学习网 2. 3 检测溶液制备
精密称取士的宁和盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含士的宁0. 012mg、盐酸小檗碱0. 015 mg 的混合对照品溶液; 取扩散池透析液1 mL，稀释1 倍后用0. 45 m 微孔滤膜滤过，取续滤液，作为释放度试验供试品溶液; 同法制备空白供试品溶液。
2. 4 方法学考察
学习啦在线学习网 2. 4. 1 专属性试验: 照上述色谱条件，分别取2. 3项下各检测溶液注入高效液相色谱仪。结果表明辅料及溶剂对测定无干扰。
学习啦在线学习网 2. 4. 2 线性关系考察: 分别精密称取对照品士的宁6. 2 mg、盐酸小檗碱8. 6 mg，置50 mL 量瓶中，分别用甲醇稀释成士的宁、盐酸小檗碱浓度为124 和172 g /mL 的母液。再分别精密量取士的宁和盐酸小檗碱母液，加甲醇稀释成浓度分别为6. 2、12. 4、24. 8、37. 2、49. 6、74. 4 g /mL 的士的宁对照品溶液和浓度分别为8. 6、17. 2、34. 4、51. 6、68. 8、103. 2g /mL 的盐酸小檗碱对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各10 L，注入液相色谱仪，测定士的宁及盐酸小檗碱的峰面积。得到士的宁的回归方程为: Y1 = 16. 348X1 + 5. 4444( r1 = 0. 9999) ，表明士的宁在6. 2 ～ 74. 4 g /mL 的浓度范围内呈良好的线性关系; 盐酸小檗碱的回归方程为Y2 = 24. 665X2 +9. 2345( r2 = 0. 9998 ) ，表明盐酸小檗碱在8. 6 ～103. 2 g /mL 的浓度范围内呈良好的线性关系。2. 4. 3 精密度试验: 取同一对照品溶液，重复进样6 次，结果士的宁和盐酸小檗碱峰面积的RSD 分别为0. 3%、0. 7%，表明仪器精密度良好。
学习啦在线学习网 2. 4. 4 稳定性试验: 取按2. 3项下方法制备的同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8 和12 h 进样检测，记录峰面积。结果士的宁和盐酸小檗碱峰面积的RSD 分别为0. 2%、0. 8%，表明供试品溶液在12h 内稳定性良好。
2. 4. 5 加样回收率试验: 精密量取已优化好基质处方的喷雾膜剂样品6 份，每份精密加入高、中、低三种不同浓度的士的宁、盐酸小檗碱对照品溶液，各平行试验2 次，按2. 3项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算平均加样回收率。测得士的宁的平均加样回收率为97. 8%，RSD 为1. 1%; 盐酸小檗碱的平均加样回收率为99. 3%，RSD 为1. 2%。2. 5 体外释放度的测定
采用改良Franz 扩散池进行测定。试验前先将半透膜用NaHCO3和EDTA活化，待用。试验时，扩散池加满接收液( 含30%乙醇的生理盐水) ，将半透膜夹在2 室中间，给药，排除气泡，恒温水浴加热，温度( 35 0. 2) ℃，磁力搅拌( 300 r /min) ，于各时间点取出部分接收液并补充相应体积的空白接收液。按2. 3项下方法制备供试品溶液并依法测定，计算累积释放率。
2. 6 正交试验设计
2. 6. 1 因素水平表: 以制剂的成膜性能( 喷雾效果、成膜时间、膜的性能) 、士的宁和盐酸小檗碱在8h 内的累积释放率为评价指标，经各项因素预试验显示，PVA17-88、乙醇和甘油用量在一定范围内其可喷雾性、快干性、成膜性、膜柔韧性、保湿性等符合临床要求，故选择PVA17-88、乙醇和甘油用量作为考察因素，采用L9( 34 ) 正交试验设计进行试验，因素水平见表1。因方中仅含两味主药，指标成分含量可用一种色谱方法测定，结合处方比例，将盐酸小檗碱和士的宁的累计释放率含量的权重系数定为。
2. 6. 2 成膜性能评分: 喷雾效果，满分30 分，以喷出均匀雾状液体为佳，评分在30 ～ 25 分之间，雾滴状液体次之，评分在25 ～ 15 分之间，线状最次，评分在15 分以下; 成膜时间，在25 ℃，75% 的相对湿度下，喷约0. 2 mL 本品于( 3 3) cm2 竖直去毛大鼠皮肤表面，以溶液不再流动的时间为成膜时间，总分40 分，以成膜时间最短者记满分，其余每增加1 min 减5 分; 膜的性能，满分30 分，考察药膜的黏附性、柔韧性，权重设为1∶ 1，柔韧性以成膜后的最大拉伸长度计分。成膜性能评分结果。
2. 6. 3 试验结果: 正交试验结果见。分析可知，成膜性能和综合释放率的影响因素顺序均为甘油 PVA17-88 乙醇，成膜性能最好的组合为C3A2B3; 而综合释放率最高的组合为C2A2B2。可知: A、B、C 三个因素均对成膜性能有显著的影响，各因素影响大小顺序为C B，最优制剂组成是C3A2B3; 因素C、A 对释放率有显著的影响，各因素影响大小顺序为C B，B 无显著影响，最优制剂组成是C2A2B2，考虑到有效成分的释放率及制剂对皮肤的刺激性，乙醇用量对释放率影响不大，但对皮肤的刺激性影响大，故选择C3A2B2，即PVA17-88 5%，乙醇用量15%，甘油6%。2. 6. 4 最优处方的验证: 依据优选的最佳处方制备3 批制剂，同法进行体外释放试验。结果膜剂成膜性能平均评分为84. 3，士的宁8 h 内累积释放率平均值为71. 8%，盐酸小檗碱8 h 内累积释放率为72. 3%，综合累积释放度为72. 1%。实验表明所选工艺条件合理可行，工艺稳定且重现性较好。分别以零级动力学方程、一级动力学方程、Higuchi 方程对膜剂体外释药数据进行拟合，结果见表5。由表5 可知，一级动力学方程的相关系数较好，故确定膜剂体外释放曲线的最佳拟合方程为Ln( 100 - Q) = - 0. 3134t + 4. 446，r = 0. 99。以时间t为横坐标，释放率R 为纵坐标作释放曲线，见图1。由图1 可知，药物在初始阶段快速释放，约3 h 即释放50%，而在后阶段释放速率减慢，约5 h 达60%，8 h 达72%。
2. 7 体外透皮试验
2. 7. 1 离体皮肤的制备: 取健康大鼠，用8% Na2S溶液脱毛，取无毛腹部皮肤，处理，冷藏备用。
2. 7. 2 供试品溶液的制备: 将鼠皮固定在Franz 扩散池装置上，角质层朝上，以含30% 乙醇的生理盐水为接受液。取膜剂0. 5 mL 注入扩散室，恒温水浴加热( 35 0. 2 ) ℃，平衡30 min 后搅拌( 300 r /min) ，分别在1、2、4、6、8、12、24 h 取接收液1 mL，同时补加等体积的接收液。按2. 3项下方法测定士的宁及盐酸小檗碱的含量，计算累积渗透率Q，结果见表6。以Q 对t 进行线性回归，得士的宁回归方程: Ln( 100 - Q) = - 0. 06t + 4. 446( r = 0. 99) ，盐酸小檗碱回归方程: Ln( 100 - Q) = - 0. 05t + 4. 443( r= 0. 99) ，均符合一级动力学方程。实验显示药物的透皮过程是药物经皮吸收的主要限速因素。
3 讨论
学习啦在线学习网 3. 1 成膜基质的选择通过查阅文献以及对常用水溶性成膜材料PVA、PVP、CMC-Na、卡波姆等的考察，PVA17-88 在成膜性、膜的柔韧性等方面均较好，性质稳定，药物在其中能均匀分散。在样品制备过程中要控制好乙醇的加入工艺，甘油对膜的形成、膜的柔软性和保湿性影响较大，但用量过大时则影响膜的成形。
学习啦在线学习网 3. 2 处方评价及优化综合考虑，将膜剂体外释放考察时间设定为8 h。评价喷膜剂质量的指标较多，包括喷雾效果、成膜性、膜的柔韧性、均匀性、黏附性和释放度等，本研究采用成膜性能和释放度结合考虑，通过正交设计试验，实现了喷膜剂多个评价指标的同步优化。其中甘油为保湿剂，PVA17-88 为成膜材料，因制剂本身含醇量 20%，故不再加抑菌剂。透皮试验中曾加入氮酮、PEG400、1，2-丙二醇等促透剂，单因素试验结果显示这些促透剂对透皮吸收有促进作用，但与不加促透剂时相比，透皮促进作用不显著，故不再加入。士的宁及盐酸小檗碱的释放和透皮均符合一级动力学方程，并反映了体外释放速率与经皮渗透速率间的关系。
3. 3 制剂的性能特点黄马酊含醇量较高，对破损皮肤刺激性大且无长效缓释作用; 改进后的膜剂含醇量降低，皮肤刺激性实验、过敏性、毒性等安全性实验显示，本制剂符合安全用药规定，可以用于完整皮肤和破损皮肤。剂型改进后，药液喷涂后迅速成膜，不仅可以有效保护创面，并能缓释给药，降低给药次数，提高了制剂的顺应性和安全性。相关的药效学实验已在进行中。
谈基于代谢组学技术的中药复方研究近况
中药复方是中药临床应用的重要形式，通过多成分协同作用实现对人体疾病的调节与治疗，其作用靶点多，一般涉及多条代谢通路，并具有时效性。传统研究手段一般只针对复方的某一功效、主治开展药效和药理研究。相比之下，代谢组学结合了大规模信息提取技术和多元变量处理技术，针对机体所有代谢产物进行分析，其研究模式与复方作用机制相契合，故近年来被广泛应用于中药复方研究。本文回顾了近五年来代谢组学技术在中药复方研究中的应用，拟通过初步分析、总结其应用概况及研究成果，讨论可能存在的问题，并展望其研究前景。
学习啦在线学习网 1 代谢组学简介
1. 1 代谢组学的起源与发展代谢组学作为系统
生物学的重要组成部分，起源于1970 年代。1999年，Nicholson 等受到核磁共振( NMR) 技术分析大鼠尿液这一实验研究的启发，最先提出代谢组的概念，认为代谢组学是生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。2000年Fiehn 等定义了代谢组学，认为代谢组学是对限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性和定量分析。
1. 2 代谢组学的主要研究层次、研究对象及研究方法
目前，代谢组学的研究层次主要分为靶标分析、代谢轮廓分析、代谢物指纹分析及代谢组学分析，相比较而言，代谢组学分析更加系统化、完整化。代谢组学利用先进的分析手段对生物单元，如生物体液、细胞或组织提取物中的一些小分子物质( 相对分子质量 1 kDa) 进行系统的测量和分析。同时结合大规模信息提取技术和多元变量处理技术，分析外源性物质及因素( 如药物、食物、环境等) 对生物体所产生的整体效应，认识机体的生理、病理状态。最后，结合模式识别和专家系统等分析方法确定生理病理状态下及外源性物质刺激引起的内源性代谢物组的变化规律，获得表征生物体在特定时间和环境下的整体功能状态与生物标志物( 群) 。
2 基于代谢组学的中药复方药效及作用机制研究
代谢组学技术的引入，为复方药效及作用机制研究提供了新思路和新方法，有助于科研得到更加全面、准确、动态的结果，促进了这一研究领域的发展。
2. 1 临床研究
学习啦在线学习网 在临床应用方面，代谢组学能够实现对血液、尿液、粪便以及唾液、精液、眼泪等生物样品的检测，与传统检测手段相比，代谢组学技术具有非破坏性，能够更全面、更快速地得到检测结果，从而提高患者的依从性。同时，代谢组学技术提供的动态分析结果，符合中药复方辨证论治的诊疗特点，能够更好地为临床服务。
林燕等研究玉屏风颗粒对反复上呼吸道感染肺卫气虚证患者的药效作用机制，研究基于液质联用技术检测患者血浆，结果表明疾病组在治疗前的代谢谱和健康组存在明显不同，经玉屏风颗粒干预后其代谢谱向健康组回归; 半胱氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸和L-蛋氨酸4 种物质为潜在证候标志物，说明玉屏风颗粒对纠正患者氨基酸代谢紊乱有重要作用。崔志新等通过NMR 代谢组学技术考察参附注射液给药后心肺复苏患者尿液代谢物的改变，发现治疗组尿样中脯氨酸、亮氨酸、缬氨酸、葡萄糖水平均上升，治疗组与对照组的代谢谱有明显差异，表明参附注射液联合常规治疗对心肺复苏患者具有明显的保护作用。施旭光等将补中益气汤用于慢性浅表性胃炎脾气虚证患者的治疗，结合代谢组学技术研究发现脾气虚证患者存在着糖、脂质、氨基酸代谢和核酸代谢异常; 研究共鉴定出甲基琥珀酸等10 种生物标记物，说明其作用机制可能与提高机体能量代谢、调整肠道菌群代谢有关。毕建璐等将补中益气丸用于健康气虚质患者并考察其血浆代谢产物的变化，发现其差异代谢产物主要与三羧酸循环相关，说明补中益气丸调节了气虚质的能量代谢异常; 同时补中益气丸通过调节伽马氨基丁酸、磷脂酰胆碱和血氨浓度来改善疲劳与记忆力下降等症状。于晓红等考察不稳定型心绞痛患者口服养心汤后血浆代谢物的变化，发现患者神经酰胺、甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸及白三烯B4与健康志愿者有明显区别，说明神经酰胺等可能为不稳定型心绞痛的生物标记物。张开泰等考察新血府逐瘀汤对冠心病心血瘀阻证患者小分子代谢谱的影响，发现乳酸、组氨酸、丙氨酸、葡萄糖、极低密度脂蛋白、亮氨酸、苏氨酸、柠檬酸等可能为冠心病心血瘀阻证的生物标记物; 用药后患者糖类、脂肪、氨基酸等物质代谢回调，从而产生治疗作用。Liu 等考察香附四物汤对原发性痛经患者的药效作用机制，发现其主要影响甘油磷脂代谢、脂类代谢和甾类激素生物合成，给药后各物质代谢回调到正常水平。
2. 2 药理学研究基于代谢组学的中药复方药效及作用
机制研究是近年来的研究热点。研究内容不仅涉及传统经方的药效及作用机制分析，更涵盖了许多医院制剂及新药的开发; 研究手段方面包含了整体研究与离体研究; 样本检测也从传统的仅选取血液、尿液样本，逐渐扩展到组织、组织液、生物膜等样品的检测分析。在整体研究方面，田俊生等，耿放等，GAO 等，张宁等分别采用抑郁大鼠模型及肝损伤动物模型探讨逍遥散作用机制，结果发现逍遥散对机体氨基酸代谢及能量代谢有回调作用，同时还可调节肠道菌群。陈阿丽等，杨永霞等，WANG 等，YUE 等，ZHANG 等分别选取胰岛素抵抗大鼠模型、脑卒中大鼠模型及关节炎大鼠模型探讨黄连解毒汤药效机制，发现黄连解毒汤可以调控机体能量代谢，减轻肝损伤。陈磊等，施旭光等，ZHENG 等等选取脾虚大鼠模型探讨补中益气汤的作用机制，结果表明补中益气汤可回调能量代谢及氨基酸代谢。蒋怀周等、张娟等基于代谢组学技术研究肝豆灵药效作用机制，研究发现其对Wilson 病大鼠的能量代谢及氨基酸代谢有调节作用。黄美艳等、李伟霞等等分别选取血虚及血瘀动物模型研究佛手散的药效作用机制，结果表明其对模型动物的氨基酸代谢有调节作用。李慧等研究表明正天丸可以调节神经细胞信息传递，提高疼痛阈值。刘志刚等选取肺气虚型慢性阻塞性肺疾病大鼠模型探讨六味补气胶囊的药效作用机制，发现其对组胺、精胺、双氢神经酰胺等有回调作用。基于代谢组学的离体药理学研究具有实验期短、样本获得相对容易等特点，是近年来复方药理研究的新方向之一。袁娟娜等研究表明香莲外洗液对白念珠菌体外生物膜具有抑制作用，主要涉及糖代谢、氨基酸代谢途径。查旭山等研究发现中药复方银屑1 号能有效降低羟基苯乙酸、胆固醇、脱氧次黄苷含量，增高甘油磷酸胆碱、碘化酪氨酸、醛固酮和7-去氢胆固醇的含量。基于代谢组学技术特点，将其引入中药复方的研究中，既能够从整体观角度考察中药复方的疗效，又能从生物标记物及代谢通路层面考察中药复方的作用机制，与传统研究手段相比较，代谢组学技术更适合中药复方的药效及作用机制研究。
3 基于代谢组学的中药复方安全性研究
学习啦在线学习网 用药安全一直是药物研究的重要问题，近年来随着中药复方在世界范围内的广泛应用，其安全性尤其含有有毒中药复方的用药安全问题更引起了极大的关注和重视。科学地阐释复方安全性问题将直接影响中医药的应用及推广。代谢组学技术能够动态监测机体的生理、病理变化，能够及时发现毒性物质及毒性规律，在监测毒性反应方面发挥了重要作用。WANG 等[69]基于核磁共振技术选用正常大鼠为动物模型，考察朱砂安神丸中朱砂的毒性作用，研究表明与单独应用朱砂相比，复方条件下可有效降低朱砂毒性，发挥其药理作用，同时调节牛磺酸、肌酐含量。Xu 等和Wang 等均选用正常大鼠为动物模型，考察牛黄解毒片中雄黄的毒性作用，研究表明牛黄解毒片能调节胆碱代谢、能量代谢及氨基酸代谢，调节肠道菌群，显著降低雄黄毒性。何家乐等、赵佳伟等研究发现，参附合并组与合煎组相比，泛醌、马尿酸的含量下降，甲硫氨酸含量上升，泛醌、泛酸、核黄素、甲硫氨酸等可能通过抗氧化方式来减轻附子的毒性; 同时发现柠檬酸、谷胱甘肽、磷脂酰胆碱、尿酸可作为心脏毒性的潜在标记物。李莹等基于代谢组学技术，采用心肌缺血-再灌注损伤大鼠心肌细胞，研究四逆汤中附子-甘草配伍的减毒增效机制，结果表明二者配伍是通过调节糖酵解、脂质代谢和三羧酸循环，同时调节氨基酸代谢中氮的代谢来发挥减毒机制。
4 基于代谢组学的中药复方配伍研究及其他
复方配伍是中医药理论体系的重要组成部分，基于代谢组学技术对中药复方配伍进行生物学表征，可以逐层明晰复方配伍的作用机制。此外，中药复方成分复杂，其药物组成、各药效组分含量及复方中各单味药的品种、产地及炮制条件均对复方的有效成分含量有重要影响。
施旭光等基于代谢组学技术比较不同配伍条件下补中益气汤的药效作用机制，结果发现与升柴加剂量组、去升麻柴胡组相比，补中益气汤原方药效作用最强，通过调节能量代谢、糖代谢及氨基酸代谢等途径改善脾气虚证。孙慧敏等应用1H-NMR技术比较红柴胡和北柴胡分别配伍制备逍遥散后的药效物质基础差别，研究共指认代谢产物19 种，与含红柴胡的逍遥散相比，北柴胡配伍后苏氨酸、丙氨酸、琥珀酸、谷氨酰胺含量相对更高，牛磺酸、果糖、蔗糖含量较低。
中药复方成分复杂，不同炮制方法对复方中各单味药药效及整个复方药效的发挥均有显著影响。陈志敏等基于代谢组学技术，研究发现二神丸的药效作用机制为调节能量代谢、氨基酸代谢等代谢途径，且盐炙补骨脂配伍麸煨肉豆蔻时药效最佳。李艺等基于1H-NMR 代谢组学技术比较龟龄集中细辛在不同炮制条件下药效物质基础的差异，结果与生品相比，细辛醋制后部分化学成分的含量有所升高; 与米醋制细辛相比，老陈醋制细辛中亮氨酸、丙氨酸、乳酸等物质的含量发生变化，表明米醋制细辛与老陈醋制细辛的代谢产物存在显著差异。此外，那丽丹等基于1H-NMR 代谢组学技术对不同厂家生产的阿胶进行质量比较，发现亮氨酸、羟脯氨酸、精氨酸等氨基酸含量有所差异，提示代谢组学技术为阿胶化学成分的差异比较提供了新方法及新思路。
5 讨论
将代谢组学技术应用于中药复方研究中，有利于中医诊疗体系病-证-方科学内涵的阐释，促进了中医药的现代化，更加快了中医药的国际化进程。但在实际应用过程中，仍不可避免地存在一些问题。一方面，受限于科学技术水平及代谢组学的发展现状，想要实现对机体全部小分子代谢物的鉴定及分析仍存在困难; 而且代谢组学应用过程中的一些关键步骤及技术仍未得到规范，实验条件的不同及人为因素都会给研究结果带来一定偏差。另一方面，现阶段针对复方的代谢组学研究仍多限于或止步于药理研究，不能很好地将药理研究与临床研究相结合，药理学研究成果尚不能很好地为临床服务，存在一定局限性。因此，笔者认为，想要将代谢组学工具化，不仅需要规范和强化研究人员自身实验操作技能，更要注重各研究团队及各学科领域间的交流，同时加强国际研讨与合作，相信随着科技的发展及研究人员的共同努力，代谢组学技术一定会不断完善，并在中医药研究领域，尤其中药复方的研究中发挥重要作用。
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