医学专业的论文的范文精选
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谈补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血损伤血脑屏障的影响
学习啦在线学习网 脑血管疾病是当前导致人类死亡和残障的主要原因之一,其中80%左右为缺血性脑血管疾病,且有逐年上升和年轻化的趋势。补阳还五汤为清代名医王清任所创的中医经典方剂,原方载于《医林改错下卷瘫痿论》,是治疗半身不遂、瘫痿不用诸症的首选方。前期研究表明,补阳还五汤可扩张脑血管、改善脑循环、对抗脑缺血后兴奋性氨基酸的毒性等。本实验采用大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)模型,观察补阳还五汤对血清中血管性血友病因子(vWF)及脑组织中血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 表达的影响,进一步阐述该方抗脑缺血的机理。
1 实验材料
1.1 动物
学习啦在线学习网 健康雄性SPF 级SD 大鼠64 只,12 周龄,体质量(28020)g,购于中国人民解放军军事医学科学院动物中心,许可证号：SCXK(军)2004-2009。
1.2 药物与试剂
补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、川芎3 g、地龙3 g、赤芍5 g、红花3 g、桃仁3 g 组成,北京大学医学院提供,经水煎、浓缩制成1 g 原药材/mL的溶液; 2,3,5- 三苯基氯化四氮唑(TTC) ： 美国(aMResco 公司,批号0765)。大鼠MMP-2、MMP-9、VEGF、vWF ELISA 试剂盒：美国RB 公司,规格96T,购于北京尚柏试剂有限公司(批号分别为63120912、28120811、27121009、52121203)。
学习啦在线学习网 1.3 主要仪器
电子分析天平(AE160 型,瑞士Mettler 公司),手术显微镜(SXP-1B,上海医用光学仪器厂),1411 型高频小电刀(上海医疗器械技术公司),低温高速离心机(Sigma 公司),光学显微镜(日本OLYMPUS 公司),切片扫描仪(蔡司光学仪器有限公司),显微图像分析系统(日本尼康公司)。
2 实验方法
2.1 造模
根据Longa 等报道的线栓法建立大鼠永久性脑缺血模型。10%水合氯醛溶液(0.35 mg/kg 体质量)腹腔注射麻醉后将大鼠仰位固定,常规碘酒、酒精消毒颈部皮肤。颈部正中作约2.5 cm 切口,暴露左侧颈动脉三角,在手术显微镜下逐层分离组织,剥离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。电刀凝闭ECA 的分支甲状腺动脉、ECA 与ICA 之间的枕动脉,结扎游离ECA 主干,分离ICA 主干至翼腭动脉(PPA),用无损动脉夹分别夹闭CCA、ICA 和PPA,用虹膜剪在ECA 残端剪一楔形小口,由此插入钓鱼线(直径0.25 mm,头端呈直径约0.3 mm 的圆球形),轻推钓鱼线使之由ECA 通过分叉部进入ICA,至大脑中动脉的起点,阻断大脑中动脉的血液供应。尼龙线插入深度由分叉处计算约18～22 mm。缝合颈部切口,假手术组手术过程与模型组相同,分离出左侧CCA 及ECA、ICA,仅结扎ECA。用缝合线结扎ECA 残端,剪断多余栓线,术区使用青霉素粉少许,逐层缝合手术切口。待清醒后,参照Bedersont 等的评分方法,3 分者为造模成功。假手术组手术过程与模型组相同,但只结扎ECA远心端,不插入栓线阻塞血管。
2.2 分组与给药将造模成功的大鼠按照神经功能评分均匀分组,分为模型组和补阳还五汤组。补阳还五汤组大鼠给予补阳还五汤水煎液,给药剂量为1.26 g 原药材/100 g体质量(相当于临床成人日用量的6.3 倍),造模后24 h 立即灌胃,之后每日称大鼠体质量,计算给药量,于相同时间点给药1 次;假手术组和模型组给予等量生理盐水。连续给药6 d,第7 日进行神经功能评分并处死取材。2.3 检测方法及观察指标2.3.1 神经功能评分 参考Bederson 等方法,总分10 分。
①提鼠尾,观察右前肢表现。1 分：内收,但不贴身;2 分：内收,贴于身体;3 分：内收贴于身体并踡缩;4 分：大鼠躯体向右侧旋转。
学习啦在线学习网 ②评价两前肢肌张力：将动物置于一金属网上,向后轻提鼠尾,观察两侧前肢肌张力。0 分：两侧前肢紧拉金属网肌力无明显差别者;1 分：右前肢拉金属网但肌力明显弱于左侧;2 分：右前肢不能拉金属网。
学习啦在线学习网 ③将动物置一光滑平面,观察侧向推挡阻力。0 分：双侧推挡阻力无明显差别;1 分：右侧推挡阻力明显弱于左侧;2 分：右推大鼠时其向右侧倾倒。
④大鼠左眼上睑下垂,左眼分泌物增多者评2 分。以上4 项评分相加为最后神经功能评分。
学习啦在线学习网 2.3.2 大鼠脑梗死体积检测
造模后第7 日,将麻醉大鼠断头取全脑后迅速放于-20 ℃冰箱中冻存15 min后,距额极2 mm 开始,以视交叉水平为中心,间隔2 mm做连续冠状切片,每个脑块切5 片,迅速投入5 mL1%TTC 溶液中,置37 ℃孵箱孵育30 min,避光。正常脑组织染成红色,缺血区呈灰白色。TTC 染色均匀后取出脑组织,放置于盛有4%多聚甲醛液的小瓶内,固定24 h,取出后滤纸吸干表面水分,用扫描仪扫出图片,计算梗死体积占大脑半球体积的百分比。
2.3.3 大鼠脑组织及微血管的形态观察
学习啦在线学习网 造模后第7 日,大鼠灌注后断头取脑,置于4 ℃、4%中性多聚甲醛固定液(pH 7.2～7.6)固定24 h 后,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,于视交叉前缘开始作5 m 厚冠状切片。常规脱蜡水化,行HE 染色,中性树胶封片。光镜下观察脑组织及微血管形态学改变。
2.3.4 大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基
学习啦在线学习网 质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子的含量测定 造模后第7 日,将动物麻醉,自腹主动脉采血,静置30 min 后离心取上清冻存备用。再取脑分离出左侧(患侧)半球放于冻存管置液氮中,检测前以生理盐水制成10%脑组织匀浆。取制备好的血清及脑组织匀浆,按照试剂盒说明操作。
3 统计学方法
采用SPSS17.0 统计软件进行分析。实验结果均以xs 表示,数据资料经正态性分布检验及方差齐性检验后,采用方差或非参数检验比较组间差异。P 0.05 表示差异有统计意义。
4 结果
4.1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响
学习啦在线学习网 动物苏醒后,模型组和补阳还五汤组都存在明显神经功能缺损,神经功能评分差异无统计学意义(P 假手术组未见神经功能缺损。灌胃6 d 后,模型组神经功能评分略增高,但前后比较差异无统计学意义(P 补阳还五汤组神经功能评分显著降低,与模型组比较差异有统计学意义( P 0.01),提示补阳还五汤能够促进大鼠的神经功能恢复,减轻缺损程度。各组大鼠神经功能评分。
4.2 补阳还五汤对大鼠脑梗死体积的影响
TTC 染色结果表明,假手术组脑片均红染,无白色梗死灶形成。模型组大鼠梗死灶位于缺血侧脑组织基底节区和额顶部外侧皮层,脑梗死灶明显。补阳还五汤组脑梗死体积显著减小,与模型组比较差异有统计学意义(P 0.05)。
4.3 病理观察结果
假手术组大鼠脑组织结构完整,灰白质边界清楚,皮质各层细胞分布基本正常;神经元排列整齐且形态多样,胞核较大、居中、着色浅、核仁清晰、胞质深染;脑微血管内皮细胞结构完整、连接紧密,未见炎细胞浸润、充血及水肿。模型组脑组织可见梗死灶,灶内结构疏松,呈水肿样,神经元丢失明显,残存的神经元细胞核固缩、浓染;脑微血管内皮细胞受损,可见炎细胞浸润,嵌塞。补阳还五汤组脑组织病理变化较模型组减轻,梗死灶体积较模型组缩小,水肿情况减轻;存活的神经元数目有所增加,血管内皮细胞受损较模型组减轻,有少量炎性细胞浸润;半暗区损伤亦有所改善。
4.4 补阳还五汤对大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子含量的影响
学习啦在线学习网 与假手术组比较,模型组VEGF、MMP-2、MMP-9 及vWF 含量显著增加(P 0.01,P 与模型组比较,补阳还五汤组VEGF、vWF、MMP-9 及MMP-2 含量显著降低(P 0.01,P 0.001)。提示脑缺血7 d 后,模型组脑组织中VEGF、MMP-2、MMP-9 及血清中vWF 均增高,补阳还五汤能阻抑其表达。
5 讨论
现代研究表明,补阳还五汤可增强微血管应激能力,缓解微血管痉挛,减轻其损伤程度,使微血管密度及微血管面积比增加,减轻缺血损伤。本实验结果表明,给永久性脑缺血动物补阳还五汤后,神经功能缺损明显改善,脑梗死体积显著减小。血脑屏障破坏可导致血管源性脑水肿和脑疝的发生,造成病情的恶化。
故减轻缺血对血脑屏障造成的损伤,保护脑组织,成为治疗的一个重要靶点。脑组织中细胞外基质(ECM)是维持血脑屏障结构完整性的重要组成部分,而MMPs 激活后能够降解ECM 成分。MMPs 是一组Zn2+、Ca2+依赖性的蛋白水解酶,正常时以酶原形式存在,在一些生理和病理条件下被激活,参与组织的损伤和修复。在脑缺血损伤中起重要作用的是MMP-2 和MMP-9,可降解ECM、破坏脑血管外基底膜主要成分,从而破坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源性脑水肿甚至出血性转化,还可使炎性细胞浸润至脑组织,引发一系列炎症反应。脑缺血后MMP-2 表达增加与早期神经元的损伤有关,MMP-9 表达增加与脑梗死后出血转化有关。MMP-9 水平的上升出现在缺血性脑卒中早期或急性期,导致血脑屏障的破坏,进一步促使神经炎症反应和神经细胞的继发性死亡。Higashida J 等研究发现,通过提高缺氧诱导因子-1(HIF-1)、水通道蛋白4(AQP4)、MMP-9 的表达可以降低血管基底膜蛋白表达和紧密连接蛋白的表达,加重脑水肿,通过抑制HIF-1、MMP-9 的表达,降低血脑屏障的通透性,但不受AQP4 的影响。Romanic 等[6]则发现应用MMP-9 单克隆抗体,梗死灶缩小了29.9%。因此我们推测,早期选择性抑制MMP-2、MMP-9 可显著减轻脑梗死。
学习啦在线学习网 本实验采用酶联免疫法检测了脑组织中MMP-2、MMP-9 蛋白表达情况,在假手术组仅有少量表达,与文献报道基本一致[9-10],脑缺血后MMP-2、MMP-9 蛋白表达量显著增加,应用补阳还五汤干预后,二者水平均显著下降,提示补阳还五汤可以通过抑制MMP-2、MMP-9 表达,保护血脑屏障,减轻脑损伤。内皮细胞是构成血脑屏障的主要物质基础。循环中的vWF 主要来自血管内皮细胞,内皮细胞受损则合成和释放vWF 增加,内皮细胞损伤越严重,则血浆中vWF 水平越高。vWF 可加速血小板黏附、聚集,介导血小板释放相关因子,干扰纤溶过程,促进血管平滑纤维化、动脉粥样斑块及血栓形成,且与疾病的轻重呈正相关。因此,vWF 被认为是心血管疾病的一个高危因素,并被作为血管内皮细胞损害的标志物。本实验脑缺血后大鼠血清中vWF 表达增高,补阳还五汤显著减少了其表达,说明补阳还五汤可以保护内皮细胞,从而维持血脑屏障结构的完整性。
VEGF 是另一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子,是内皮细胞特异性的促有丝分裂源,能促进内皮细胞分裂、增殖增生和转移,它在血管生成的各个阶段均发挥着重要作用,是目前公认的血管新生中最关键的因子。本实验假手术组VEGF 有少量表达,模型组VEGF 表达量增高,这可能是缺血性脑损伤诱导VEGF 基因早期表达的缘故;应用补阳还五汤干预后,VEGF 显著降低,笔者认为,这可能和VEGF 的动态表达有关。因此,可以推测,补阳还五汤可通过多环节调节VEGF,保护血脑屏障。
目前,西医治疗脑缺血及其后遗症尚无突破性进展,而中医药防治脑缺血具有很大潜力。本实验显示,补阳还五汤能改善神经功能缺损,减少脑梗死体积,其发挥作用的机理可能是通过抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表达而保护血脑屏障,也可能是通过调控VEGF、vWF等内皮活性因子,改善微循环,促进脑血流的恢复。
谈不同比例士的宁对马钱子碱体外经皮渗透性质的影响
马钱子又名番木鳖，为马钱科马钱属植物马钱(Strychnosnux-vomica L.)或云南马钱(S.pierriana A.W. Hill)的干燥成熟种子，主要有效成分为生物碱类。包括士的宁、马钱子碱、士的宁氮氧化物、马钱子碱氮氧化物、异马钱子碱、伪马钱子碱等，约占总量1%-5%。其中士的宁和马钱子碱约占总生物碱的70%。马钱子生物碱作用于免疫、神经、心血管等系统，具有抗炎及免疫、镇痛、抗肿瘤等显著疗效。主要有效成分马钱子碱具有很强的抗炎镇痛和关节炎滑膜细胞增殖抑制作用，而士的宁在抗炎镇痛方面活性较差，且毒性较强，其口服中毒量是马钱子碱的1/71。因此马钱子制剂中士的宁的含量会直接影响制剂的药效及毒性。
学习啦在线学习网 研究表明，马钱子制成经皮给药制剂对风湿痹症等具有较好疗效，但其毒性，尤其是士的宁是亟待解决的问题之一。为达到治疗的增效减毒，本实验利用体外经皮扩散方法，探讨士的宁与马钱子碱在不同比例下，马钱子碱的经皮扩散行为，为马钱子的炮制及其经皮制剂的研究等应用方面提供参考依据。
材料
1. 动物
学习啦在线学习网 清洁级雄性ICR小鼠30只，体质量(20.03.0)g，浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)2008-0033。
2. 仪器
1200 Agilent高效液相色谱(美国Agilent公司);RYJ-12B药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司);XS205电子微量天平(瑞士Mettler Toledo公司);STARTER2100酸度计(美国OHAUS公司)。
3. 试药
学习啦在线学习网 马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110706-200505，纯度95.9%);士的宁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110705-200306，纯度97%);马钱子碱纯品(南京泽朗植提技术有限公司，批号：ZL110116，纯度97.2%);士的宁纯品(南京泽朗植提技术有限公司，批号：ZL110120，纯度96.2%);马钱子购于杭州华东中药饮片有限公司，批号：101011，经该公司质检科郑霄鹰主管药师鉴定为马钱科植物马钱子(Strychnos nux-vomica.L.)的干燥成熟种子;马钱子总生物碱提取物1(自制，批号：20120608，马钱子碱含量94.1%);马钱子总生物碱提取物2(自制，批号：20120828，马钱子碱含量27.01%，士的宁含量2 6 .95%，总生物碱含量67.38%)。乙腈(美国Tedia公司，批号：14035045，色谱纯);其他试剂均为分析纯。
方法
1. 透皮接受液中马钱子碱、士的宁的含量测定方法研究
学习啦在线学习网 1.1 色谱条件
色谱柱：Agilent SB-C18柱(4.6mm150mm，5流动相：乙腈-0.01moL/L庚烷磺酸钠与0.02moL/L磷酸二氢钾等量混合(10%磷酸调pH值为2.80)(21∶79);流速：1.0mL/min;检测波长：260nm;进样量：20柱温：室温。
1.2 对照品溶液的制备
学习啦在线学习网 精密称量马钱子碱、士的宁对照品适量，甲醇溶解，流动相稀释至浓度分别为38.80、45.20g/mL。
学习啦在线学习网 1.3 供试品溶液的制备
学习啦在线学习网 取透皮接受液，0.45m微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
1.4 标准曲线
取1.2项下对照品溶液，分别进样5、10、15、20、30、40、50、60L，在上述色谱条件下进行检测。相应对照品峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标进行线性回归，得到马钱子碱回归方程Y=1 767.7X-39 093，r=0.9999，马钱子碱在0.194-2.328g内线性关系良好。得到士的宁回归方程Y=2 352.3X-2 9943，r=0.9929，士的宁在0.226-2.712g内线性关系良好。
学习啦在线学习网 1.5 仪器精密度试验
精密吸取对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积的RSD值分别为0.19%，0.18%，说明仪器精密度良好。
学习啦在线学习网 1.6 重复性试验
平行制备供试品溶液6份，进样检测，计算马钱子碱和士的宁的RSD值均为0.32%。说明此方法的重复性良好。
学习啦在线学习网 1.7 加样回收率试验
精密量取已知含量马钱子碱18.79g/mL，士的宁3.57g /mL的上述供试品溶液6份，每份0.5mL，各加0.2mL混合对照品溶液，流动相定容至2mL，在上述色谱条件下进行检测，计算回收率，结果见表1。测得马钱子碱和士的宁的平均回收率为96.74%，99.28%，RSD值分别为0.99%，0.55%(n=6)。说明此方法准确度良好。
1.8 样品溶液稳定性试验
学习啦在线学习网 取上述供试品溶液置于37℃条件下(n=6)，24h后测定含量，马钱子碱、士的宁的RSD值分别为1.17%和1.52%，表明在37℃条件下透皮接受液中马钱子碱和士的宁在24h内稳定性良好。
2. 体外经皮吸收实验
2.1 接受介质的配制
称取氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，磷酸氢二钠3.63g，磷酸二氢钾0.2 4g，加蒸馏水溶解定容至1 0 0 0mL，即得pH值7.40磷酸盐缓冲液(PBS)。量取80 0mLPBS加入200mL无水乙醇，混匀，即得20%乙醇的PBS溶液。
2.2 样品溶液的配制
马钱子碱溶液的配制：精密称取马钱子碱纯品适量，接受介质溶解稀释至浓度为1.56mg/mL。士的宁溶液的配制：精密称取士的宁纯品适量，接受介质溶解稀释至浓度为0.48mg/mL。马钱子总生物碱提取物1溶液的配制：精密称取马钱子总生物碱提取物1适量，接受介质溶解稀释至马钱子碱浓度为1.62mg/mL。马钱子总生物碱提取物2溶液的配制：精密称取马钱子总生物碱提取物适量，接受介质溶解稀释至马钱子碱浓度为0.829mg/mL，士的宁浓度为0.797mg/mL。按一定比例吸取上述马钱子碱、士的宁溶液，制得不同比例的纯品组;马钱子总生物碱提取物1溶液中加入适量马钱子总生物碱提取物2溶液，制得不同比例的提取物组。
2.3 离体皮肤的制备
取雄性健康小鼠，用7%硫化钠溶液(含5%甘油)活体脱去其背部毛发后0.9%氯化钠溶液洗净皮肤，擦干后饲养12h。处死后剥离背部皮肤，剔除皮下脂肪和黏连物，0.9%氯化钠溶液洗净，待用。
学习啦在线学习网 2.4 离体透皮实验
将小鼠皮肤自然固定在改良的Franz扩散池两室之间，皮肤角质层朝向供药室，有效扩散面积为2.8cm2，接受室容积为6.5mL。接受室中加入37℃预热的接受介质，皮肤与接受液间紧密贴合，排尽气泡。供药室中分别加入0.5mL上述比例的纯品组和提取物组溶液，(37.01.0)℃恒温水浴加热，以600r/min磁力恒速搅拌。分别于给药后2、4、6、8、10、12、24h取样5mL，并补加5mL 37℃预热的新鲜接受介质。HPLC法测定马钱子碱，士的宁含量。根据各取样点接受液中马钱子碱，士的宁含量，计算单位面积药物累积透过量(Q)及稳态渗透速率(J)。Q计算公式如下：Q=(V0Cn+Vn-1i-1Ci)/A (1)其中Q为单位面积累积透过量(A为有效透皮吸收面积(cm2);V0为接受液体积(mL);V为取样体积(mL);Ci、Cn为第i(in-1)、n个取样点测得接受液中药物浓度(g/mL)。并按公式(2)计算累计透过百分率Q%。Q%=QA/QT (2)其中QT为上样的总药量(g)。
结果
学习啦在线学习网 1. 马钱子碱的透皮结果
学习啦在线学习网 马钱子碱在纯品组及提取物组中透皮累积渗透曲线。透皮速率及累积透过百分率。随着士的宁比例的增加，纯品组及提取物中组马钱子碱的J及Q%依次减小。当比例为1∶0.6，提取物组与纯品组进行比较，Q%明显升高(P0.05)，J增大，说明可能其他生物碱的存在对马钱子碱的透过有一定的影响。
2 . 士的宁的透皮结果
学习啦在线学习网 士的宁在纯品组及提取物组中透皮累积渗透曲线。透皮速率及累积透过百分率。
讨论
学习啦在线学习网 本研究发现：随着士的宁比例的增大，士的宁的J与Q%逐渐升高，而马钱子碱的J与Q%随之降低。说明提取物或混合物中士的宁均可抑制马钱子碱的透皮吸收性能，且随着士的宁比例的增大抑制效果增强，这与胡巍等[13]报道的结果有所出入。由马钱子碱和士的宁的结构式可知：其结构和物理化学性质相似，透皮吸收时产生同质竞争抑制是有可能的。但是，不同实验动物乃至人体皮肤的实验结果是否也类似，以及具体机制等均需通过进一步实验研究加以确证。此外，研究结果还表明：马钱子总生物碱提取物中其他生物碱等能够促进士的宁的透皮吸收。由此证明，马钱子生物碱用于类风湿关节炎治疗时，尽可能降低士的宁的含量，对增效减毒具有重要意义。马钱子治疗类风湿性关节炎效果显著，但由于毒性较强极大限制临床应用。本研究的发现可为马钱子的炮制和经皮给药制剂研究应用等方面提供依据参考。
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